Фототермический эффект при облучении меланина лазером с длиной волны 808 нм: обоснованное исследование

Фототермический эффект при облучении меланина лазером с длиной волны 808 нм: обоснованное исследование

Фототермический эффект вызывает большой интерес из-за достижений в новых фотосенсибилизирующих материалах и более подходящих источниках света, но исследованиям часто мешает необходимость использования экзогенных фототермических агентов и дорогостоящих устройств для облучения. Здесь мы представляем простую стратегию, основанную на прямом NIR-облучении пигмента меланина с помощью коммерческого лазера с длиной волны 808 нм. Доказательные исследования показали эффективное фототермическое воздействие на меланин in vitro и in vivo. После облучения NIR у мышей BALB / c с опухолями меланотической меланомы B16-F10 обнаружены серьезные гистопатологические повреждения и массивный некроз в меланинсодержащих опухолевых тканях, в то время как окружающие здоровые ткани не выявили повреждений. Таким образом, реализуемость данного подхода может позволить реализовать прямые процедуры фототермической терапии пигментных опухолей.

Введение

У слабопигментированных людей (европеоидов) высока заболеваемость меланомой кожи. Напротив, в сильно пигментированных популяциях людей и у афроамериканцах наблюдается меньшая заболеваемость меланомой, что, по-видимому, связано с защитным действием меланина от УФ-излучения, хотя в этих случаях болезнь проявляется более агрессивно. Очевидно, экспериментальные исследования на мышиных моделях с участием меланотических клеток очень важны для биологии и лечения опухолей меланомы у людей.

Мышиная меланома B16, возникшая и растущая в линии черных мышей C57BL / 6, является одной из самых популярных и широко используемых моделей опухолей в онкологических исследованиях. В 1980 г. Пост и Фидлер выделили из него устоявшуюся линию клеток B16-F10, обладающую высокой метастатической способностью, что открыло широкое поле субпопуляций в биологии метастазов. Известно, что мышиные клетки и ткани из одного штамма отвергаются иммунной системой при инокулировании в другой штамм (за исключением мышей с подавленным иммунитетом). Таким образом, меланома B16-F10 от мышей C57BL / 6 отторгается иммунной системой при инокулировании мышам гистонесовместимого штамма BALB / c, поскольку антиген гистосовместимости (H2) C57BL / 6 — это H2b, но у BALB / c это H2d.

Недавно один из нас (L.L.C.) получил пересаженную форму меланомы B16-F10. Эта новая меланотическая опухоль способна расти в подкожной клетчатке белых гисто-несовместимых мышей BALB / c, и в настоящее время проводится дальнейшая характеристика. В настоящей работе мы решили воспользоваться преимуществами этой новой пересаженной меланомы, потому что она на один шаг ближе к тому, что происходит у людей, у которых меланотические опухоли обычно имеют высокую заболеваемость (в основном в географических районах с интенсивным солнечным излучением, таких как Аризона или Австралия со слабо пигментированными популяциями).

С терапевтической точки зрения хорошо известно, что фотодинамическая (PDT) и фототермическая терапия (PTT) одобрены и в настоящее время применяются в клинических противоопухолевых лечениях с использованием соответствующих фотосенсибилизаторов и облучения в красном или ближнем инфракрасном (NIR) диапазоне. Поглощение и рассеяние света в большинстве мягких биологических тканей очень низки в спектральной области от красного до ближнего инфракрасного (между 600 и 1300 нм), в так называемом биологическом (диагностическом и терапевтическом) окне, с самым низким поглощением при 810-820 нм. В настоящее время БИК-лазерное излучение находит множество применений в различных областях, в основном в косметике (удаление волос и татуировок, шлифовка кожи и фотолечение сосудистых заболеваний). Рубиновый (694 нм), александритовый (755 нм), диодный (800-810 нм) и Nd: YAG (1064 нм) лазеры являются наиболее часто используемыми источниками света для фототермической эпиляции на основе меланина и PTT. Новые красители и наночастицы NIR также исследуются для биомедицинской визуализации, а также фототермические агенты для PTT. PTT основан на локальном тепловыделении во время воздействия света. Диссипация тепловой энергии происходит от возбужденных светом молекул за счет внутреннего преобразования и релаксации колебательных уровней энергии, вызывая быстрый нагрев. Ключевым элементом фототермического эффекта является эффективное преобразование энергии электронного возбуждения в колебательную энергию и тепло.

По сравнению с PDT, PTT имеет то преимущество, что оно не зависит от доступности O2 в обрабатываемой опухоли, и для индукции биологической ре необходим только эффективный механизм быстрого преобразования света в тепло. Фототермический эффект (селективный фототермолиз) впервые применили Андерсон и Пэрриш на моделях кожи и основан на избирательном поглощении коротких лазерных импульсов, которые генерируют и удерживают тепло в определенных пигментированных клетках и тканях за счет безызлучательного термического распада. Лазерный импульс вызывает высокую температуру пигментированной (поглощающей) мишени, в то время как окружающие ткани не нагреваются. Напротив, при длительном облучении происходит передача тепла, и вся ткань повреждается коагуляционным некрозом.

В последние несколько лет материалы на основе углерода использовались для эффективного создания фототермического воздействия на биологические субстраты, в основном экспериментальные опухоли. Недавно мы сообщили, что пигментная сажа (CI: 77266) из китайских (индийских) чернил является эффективным фототермическим агентом при введении в опухоли белых мышей и облучении лазером с длиной волны 808 нм. Исходя из предположения, что клетки меланотической меланомы действительно содержат меланин в качестве внутреннего хромофора черного цвета, и что структурные и оптические характеристики этого биополимера аналогичны материалам с квазиграфитовой структурой, содержащим сажу, мы решили для оценки фототермических эффектов этого эндогенного и легко доступного внутреннего пигмента, в основном в клетках меланомы. Кроме того, настоящая модель на мышах (белая кожа) очень адекватна, потому что, если использовать облучение лазером NIR меланотических меланом, растущих у черных мышей, нормальная, но впитывающая кожа также будет сильно затронута. В этой работе используются демонстрационные доказательства концепции и простая в реализации установка, демонстрирующая прямое фототермическое воздействие на меланотические опухоли с использованием БИК-излучения коммерческой лазерной указки.

Материалы и методы

БИК-облучение

Портативный коммерческий лазерный указатель NIR использовался для облучения модельных субстратов и опухолей мышей. Длина волны излучения, предоставленная поставщиком, составляет 808 ± 3 нм. Излучение является непрерывным, а излучаемая мощность составляет ~ 200 мВт при измерении с помощью термобатареи (LM-10, Coherent Inc., США). Диаметр луча составляет ~ 1, 2 мм, что соответствует интенсивности излучения ~ 17, 68 Вт / см2. Во всех случаях расстояние между выходом лазера и различными облучаемыми мишенями оставалось постоянным и составляло 10 см. На этом расстоянии площадь пятна лазерного луча составляла ~ 1, 1 мм2.

Спектры и модельные эксперименты in vitro

Спектры поглощения и фототермическая оценка были выполнены с использованием сепиомеланина, который аналогичен эумеланину млекопитающих. Сепиомеланин — это пигмент эумеланин, выделенный из чернильного мешка каракатицы. Чернила каракатицы или сепиисостоят из суспензии небольших темных меланинсодержащих гранул в бесцветной плазме. Спектры поглощения снимали чернилами сепия, разбавленными 1: 2000 (об. / Об.) дистиллированной водой, на спектрофотометре UV-VIS 1604. Для сравнения также записывали спектры китайских чернил (черные чернила для рисования Pelikan Z, Pelikan AG, Ганновер, Германия), разбавленных 1: 2000 (об. / Об.) дистиллированной водой.

Кинетические измерения точки воспламенения и повышения температуры были выполнены с использованием различных концентраций чернил сепия и времени облучения. В первом случае полосы белой бумаги пропитывались различными разбавлениями чернил сепии в дистиллированной воде, сушились на воздухе и облучались лазером с длиной волны 808 нм, регистрируя время, прошедшее до воспламенения. Повышение температуры чернил сепия также оценивалось с помощью химического термометра, расположенного на расстоянии 10 см от выходного лазерного луча. Колбу термометра сначала окружали гильзой из бумажной полоски, пропитанной 50% чернилами сепии, покрывали прозрачной липкой лентой для предотвращения испарения и высыхания бумаги, а затем подвергали облучению в ближней инфракрасной области.

Трансплантация меланотической опухоли

Трансплантация меланотической опухоли у белых мышей была проведена инбредным самкам мышей BALB / c в возрасте 2–4 месяцев из зоны разведения Института онкологии, содержащихся в помещении с контролируемой температурой (20 ± 2 ° C) и освещением с бесплатным доступом к воде и диетическому питанию. Уход за животными осуществлялся в полном соответствии с правилами защиты животных в институте.

Наряду с предыдущим направлением исследований опухолей несколько белых мышей BALB / c были предназначены для иммунизации против аллогенной меланотической меланомы B16-F10 (от черных мышей C57BL / 6) путем подкожной (sc) инъекции ~ 106 культивируемых клеток. Неожиданно у одной из белых мышей выросла черная опухоль без каких-либо признаков регресса. Затем кусочки размером около 1 мм3 этой опухоли трансплантировали (подкожно троакаром) в бок пяти мышей BALB / c. У двух мышей опухоли никогда не развивались, в двух других случаях опухоли росли, но в конце концов они регрессировали, и у одного животного опухоль росла без регресса. От этой мыши кусочки черной опухоли размером около 1 мм3 снова трансплантировали в бок другим пяти мышам BALB / c. Поскольку пересаженные меланомы неоднородны по пигментации, для трансплантации использовались только более пигментированные (черные) области. Эта процедура повторялась в течение нескольких месяцев, постепенно увеличивая процент мышей без регресса опухоли. В настоящее время мы близки к достижению 100% успеха в росте опухоли без регресса.

Фототермические эксперименты с опухолями

Черные опухоли диаметром около 10 мм у мышей BALB / c были подвергнуты контролю (без лечения, n = 2) и экспериментальным протоколам (NIR-облучение, n = 5). Вышележащие волосы на опухолях и окружающих участках кожи были подстрижены, и перед лазерным лечением была проведена анестезия путем внутрибрюшинной инъекции 0,2–0,3 мл раствора ксилазина (20 мг / кг) и кетамина (50 мг / кг) в физиологическом растворе. Опухоли облучали в течение 4, 6 и 10 мин лазером с длиной волны 808 нм, закрепленным на металлическом каркасе для сохранения постоянного расстояния до мишени.

Чтобы уменьшить рассеяние света слоями кератина, на выбритую кожу, покрывающую область опухоли, наносили каплю глицерина. В одном случае петля была проделана на коже над опухолью, и затем поверхность опухоли была подвергнута прямому облучению, таким образом избегая лежащей сверху белой кожи. Через 24 часа после обработки мышей умерщвляли, опухоли иссекали, фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 часов и заливали парафином. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином Gill’s II и эозином Y (H&E), наблюдали и фотографировали под световым микроскопом.

Результаты и обсуждение

Фототермические эксперименты in vitro

Меланосомы млекопитающих представляют собой сферические или эллипсоидные гранулы размером около 0,5–1 мкм с эумеланином в качестве основного пигмента. Хотя точная макромолекулярная организация эумеланинов до сих пор остается спорной, существует консенсус относительно их основной химической структуры, которая соответствует линейным полимерам индол-5,6-хинона и индол-5,6-хинон-2-карбоновой кислоты (а также 5 , 6-дигидроксипроизводные), с 4,7 ‘связями и высоким уровнем сопряженных двойных связей. Этот биополимер способен рассеивать> 99,9% поглощенного УФ и видимого излучения за счет безызлучательного распада, и поэтому он является очень подходящим фототермическим агентом.

Сепия меланин показала широкополосный бесструктурный спектр оптического поглощения с уменьшающимися значениями от УФ к ближнему ИК диапазону, что согласуется с предыдущими наблюдениями. Сравнительные кривые поглощения чернил сепия (A) и чернил China (B) показали одинаковые широкополосные характеристики, характерные для ненасыщенных полимерных хромофоров с высоким уровнем конъюгации двойных связей. Эксперименты, касающиеся времени воспламенения бумажных полосок, пропитанных чернилами сепии различной концентрации, высушенных и затем облученных лазером с длиной волны 808 нм в течение разного времени, показали очень быстрое воспламенение пятен меланина. Средняя температура воспламенения бумаги составляет 230 ° C, и ее можно рассматривать как четкую конечную точку фототермической ре. Точно так же кинетика повышения температуры воды и чернил сепия под действием БИК также выявила разительные различия. После 4 мин облучения 808 нм температура 50% -ных чернил сепии достигла 58 ° C, тогда как температура воды осталась неизменной. Очевидно, что этот большой фототермический эффект должен вызвать значительное биохимическое и механическое повреждение тканей.

Фототермические эксперименты in vivo

В гистологических срезах, окрашенных H и E, необлученные опухоли от контрольных животных показали типичную морфологию меланотической меланомы B16-F10 с большими многогранными клетками, содержащими различное количество меланосом. Хотя наличие пигмента меланина в контрольных срезах явно наблюдалось в большинстве клеток из областей черной опухоли, также были обнаружены большие внеклеточные отложения меланина.

Как и ожидалось на основании результатов in vitro, гистопатологические наблюдения показали, что NIR-облучение вызывает явное и обширное повреждение тканей, обычно большее в областях опухоли с большим количеством меланина. Срезы облученных опухолей показали массивный некроз, пикнотические ядра, повышенную эозинофилию, сильно дезорганизованную строму и отек, большие и круглые коричнево-черные меланофаги и разрушенные опухолевые клетки с высвобождением меланина и фрагментов цитоплазмы. Не только меланин-содержащие клетки были повреждены БИК-излучением, но и соседние клетки (опухолевые клетки с меньшими или отсутствующими меланосомами, клетками стромы) оказались сильно поврежденными. Это может означать эффект наблюдателя из-за тепловой волны / механической волны, воздействующей на области опухоли вблизи меланинсодержащей лазерной мишени. Однако также наблюдались редкие жизнеспособные опухолевые клетки, демонстрирующие митоз. Степень повреждения тканей была сопоставима после разного времени облучения. Облучение через петлю на коже также было эффективным, и не было обнаружено заметных различий по сравнению с облучением через нормальную кожу. Кроме того, кожа над облученным участком опухоли оставалась неповрежденной, без признаков повреждения клеток. Кровеносные сосуды не были явно повреждены, и внутри опухолей не было обнаружено геморрагических участков.

Несколько экспериментальных исследований с использованием излучения лазера NIR были проведены на нормальной коже и широко применяются для удаления волос. Насколько нам известно, попытки лечения меланотической меланомы непосредственно с помощью облучения лазером ближнего инфракрасного диапазона были в значительной степени упущены, хотя клеточная линия амеланотической меланомы B78-H1 иногда применялась в исследованиях PTT с использованием цианинов, нафталоцианинов и облучения ближним инфракрасным излучением. В ранних исследованиях с использованием лазера 351 нм наблюдались дегенеративные и некротические изменения в нормальных меланин-содержащих кератиноцитах человека и разрушение меланосом. Хорошо известно, что после сильного и быстрого нагревания импульсами лазера ближнего ИК-диапазона коагуляция белков вызывает «коагуляционный некроз» с последующим гемостазом. Тот же процесс происходит при термодиффузии во время и после длительного воздействия БИК-излучения. Известно, что опухолевые клетки более чувствительны к повышению температуры, чем нормальные клетки. В настоящее время температуры 42-43 ° C считаются смертельными для опухолевых клеток, а меньшее тепловыделение из-за нарушения кровотока в опухолях по сравнению с нормальными тканями способствует тепловому ограничению и более высокому вредному эффекту. Интересно, что предварительные результаты показали, что лечение непигментированной мышиной опухоли синтетическим дофамин-меланином с последующим БИК-облучением вызывало летальные фототермические эффекты.

Другими причинами повреждения тканей фототермическими эффектами могут быть взрывное испарение меланосом in situ с серьезным повреждением пигментированной кожи и генерация акустических ударных волн, вызванная фототермическим воздействием. Это кажется важным в нашем экспериментальном контексте, поскольку наблюдаемая картина повреждения опухоли на клеточном уровне полностью совместима с фототермическими механическими повреждениями облученного образца. На наш взгляд, заслуживает особого внимания тот факт, что это было достигнуто с помощью непрерывного лазера умеренной интенсивности (200 мВт), а не импульсного. Действительно, фототермическое воздействие в наших экспериментах напоминает аналогичное явление термокавитации, при котором непрерывный лазер способен запускать циклы зарождения-кавитации-схлопывания пузырьков в условиях умеренного поглощения света облучаемым объемом. Кроме того, во время облучения меланотической опухоли были слышны «хлопающие» звуки, что предположительно свидетельствует о тепловом (микро) пузырьковом развитии и схлопывании во время лазерного воздействия.

Существует очень мало клинических испытаний по ЧТВ и раку (только 2 из 17 305), и не было обнаружено никаких исследований в случае опухолей меланомы, непосредственно подвергнутых протоколам ЧТВ. Помимо хирургического вмешательства, в настоящее время доступны другие варианты лечения меланомы (например, химио-, радио-, иммунотерапия, таргетная терапия, ФДТ), но все еще необходимы дальнейшие исследования и усовершенствованные протоколы при продолжении разработки и утверждения новых и более эффективных методов лечения опухолей меланомы и метастатической меланомы. Как и в случае с PDT, применение PTT ограничено проникновением света внутрь тканей, что в основном связано с поглощением и рассеянием света. Хотя БИК-излучение проникает глубже, чем видимый свет, опухоли, расположенные в глубине органов, трудно полностью удалить с помощью этих фототерапевтических процедур. Очевидно, что для увеличения фототермической реакции опухолей необходимо достичь таких усовершенствований, как лазеры ближнего инфракрасного диапазона с более высокой мощностью и большим диаметром луча. Однако нашей целью в этой работе было представить доказательную процедуру, основанную на использовании меланина в качестве внутреннего хромофора в опухолях меланомы и прямом облучении непрерывной лазерной указкой 808 нм для достижения быстрого, легкого и эффективного фототермического отклика. Интересно, что фототермическое лечение во время или после хирургической резекции меланотических опухолей может быть подходящим дополнением для удаления некоторых оставшихся областей опухоли или разбросанных опухолевых клеток. Мы надеемся, что представленная методология и результаты позволят продвинуться дальше в области фототермической терапии.

Выводы

Меланин является очень подходящим инфракрасным фототермическим хромофором, и исследования модельных систем in vitro показывают, что очень быстрый и сильный фототермический эффект возникает в сепиомеланине, облученном БИК, с почти мгновенным воспламенением высушенных образцов и значительным повышением температуры водных растворов. Гистопатологические наблюдения показывают, что массивный некроз опухолевой ткани появляется в областях, облученных БИК, меланотической меланомы B16-F10, успешно трансплантированной белым мышам BALB / c. Принимая во внимание наши настоящие результаты, использование непрерывной лазерной указки с длиной волны 808 нм в качестве источника света подтверждает потенциальную ценность прямого БИК-излучения для терапии пигментных опухолей кожи.

Поделитесь этим:
Подписаться
Уведомление о
guest
0 Комментариев
Встроенные отзывы
Cмотреть все комментарии

Поиск

Клуб предпринимателей

Обсуждение бизнеса Украины

Задать Вопрос

Помочь развитию проекта

Поблагодарить или поддержать проект

Поблагодарить

Поблагодарить БизнесМаркет

Лучшее на крипторынке

КРИПТОВАЛЮТНЫЕ ПЛОЩАДКИ ТРЕЙДИНГА NEW

  • Рейтинг пользователей: 4.9 (10 отзывов)
    Тип площадки
    Криптовалютная мега-биржа
    Рынки
    Криптовалюта и цифровые активы (630+)
    Лого Visa-MastercardФиатные валюты
    UAH, USD, EURO, RUB + Visa/Mastercard
    Открыть
    Binance
     
  • Рейтинг пользователей: 4.7 (10 отзывов)
    Тип площадки
    Криптовалютная биржа
    Рынки
    Криптовалюта и цифровые активы
    Лого Visa-MastercardФиатные валюты
    10+: USD, EURO, GBP идр., Visa/Mastercard
    Открыть
    FTX
     
  • Рейтинг пользователей: 4.5 (10 отзывов)
    Тип площадки
    Криптовалютная биржа, Обменник
    Рынки
    Криптовалюты, Фьючерсы, Индексы, ОТС
    Лого Visa-MastercardФиатные валюты
    SWIFT, FewWire, Silvergate, SEPA. Visa/Mastercard – НЕТ
    Открыть
    Kraken
     
  • Рейтинг пользователей: 4.47 (10 отзывов)
    Тип площадки
    Криптовалютная биржа
    Рынки
    Криптовалюта и цифровые активы
    Лого Visa-MastercardФиатные валюты
    USD, EURO, GBP и др., Банковский перевод
    Открыть
    Crypto.com
     
  • Рейтинг пользователей: 4.47 (10 отзывов)
    Тип площадки
    Криптовалютная биржа, обменник
    Рынки
    Криптовалюта и цифровые активы (700+)
    Лого Visa-MastercardФиатные валюты
    UAH, USD, EURO, 40+, Visa/Mastercard, SEPA, Apple Pay, Google Pay и др.
    Открыть
    KuCoin
     

Полезное о бизнесе

Сверху